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中科院神經(jīng)所在世界上首次獲得基因敲入的食蟹猴

中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組與蘇州非人靈長類研究平臺孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作,利用了一種以同源臂介導(dǎo)的末端接合(HMEJ)為基礎(chǔ)的基因敲入策略,在世界上首次獲得了基因敲入的食蟹猴。1月12日,這一重要研究成果以題為《運(yùn)用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得基因敲入食蟹猴》在線發(fā)表于《細(xì)胞研究》期刊。

由于基因修飾猴模型可以用于模擬人類疾病癥狀,因此它可以作為研究人類疾病機(jī)制和推進(jìn)臨床治療的工具。然而,由于普通猴具有繁殖周期長(5-6年一代),幼仔數(shù)量少(每胎一只)以及基因編輯效率低等特點(diǎn),導(dǎo)致構(gòu)建靶向基因編輯猴具有很大的困難和挑戰(zhàn)性。最近的一些研究表明,CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用于構(gòu)建基因敲除猴。然而,與基因敲除相反,由于種種原因例如效率低,到目前為止仍然還沒有基因成功敲入猴的報(bào)道。

基于實(shí)驗(yàn)室之前的研究,同源臂介導(dǎo)的末端接合(HMEJ)的方法可以有效地在獼猴胚胎上實(shí)現(xiàn)高效的靶向基因整合。研究人員進(jìn)一步優(yōu)化受精卵注入條件,包括供體質(zhì)粒濃度以及注射劑量,期望在提高敲入效率的同時(shí)保持正常的胚胎發(fā)育,進(jìn)而獲得基因敲入的猴子。具體來說,研究人員在Actb (β-actin)位點(diǎn)插入p2A-mCherry以實(shí)現(xiàn)mCherry在Actb啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在經(jīng)歷完整的懷孕周期后,研究人員成功地獲得了一對雙胞胎猴(#1,雄;#2,雌)和三只單胎的雌性猴(#3、#4和#5)。通過直接表皮熒光觀察兩只新生猴(#1,#5)的腳趾發(fā)現(xiàn),與野生型相比,#1和#5展現(xiàn)出mCherry熒光。對兩只死亡雌猴子(#2,#3)的各個(gè)組織進(jìn)行切片觀察,發(fā)現(xiàn)尾巴、腳趾、心臟、肌肉、心臟、腎、大腦和卵巢均顯示出不同嵌合程度的mCherry表達(dá)。值得注意的是,研究人員在卵巢的大部分區(qū)域都檢測到mCherry的表達(dá),說明基因敲入猴子具有生殖系傳遞的可能性。所有組織的PCR鑒定測序結(jié)果都表明在5’和3’連接處的整合是正確的。此外,Southern印跡分析進(jìn)一步證實(shí)# 2和# 3猴的基因整合是正確的且沒有額外的基因隨機(jī)整合。

研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HMEJ策略,通過一細(xì)胞胚胎注射首次成功地獲得了基因靶向整合的食蟹猴?!睂<冶硎?,基于其強(qiáng)大的DNA敲入效率和高保真性,HMEJ介導(dǎo)的敲入策略為構(gòu)建靶向基因修飾的猴模型提供了可能性。

據(jù)介紹,這項(xiàng)工作由助理研究員姚璇、博士后劉真與研究生王興在靈長類疾病模型研究組楊輝研究員與蘇州非人靈長類研究平臺主任孫強(qiáng)博士的指導(dǎo)下完成。并得到國家科技重大專項(xiàng),中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng), 國家高科技研發(fā)項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金會, 中國青年千人計(jì)劃, 中國科學(xué)院重大突破項(xiàng)目、國家關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目, 上海市科學(xué)技術(shù)委員會項(xiàng)目,中科院百人計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。


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